Si bien es cierto que la amplificación de ADN es un proceso de rutina en los laboratorios de biología molecular, no deja de ser una etapa fundamental y crítica para la obtención de resultados. Sin lugar a dudas, existen limitantes en este proceso, las que se relacionan con la disminución de costos, la velocidad en la obtención de resultados, las etapas de preparación de muestras, el tipo y cantidad de muestra a tratar, entre otras. En este artículo, presentamos dos alternativas de amplificación que favorecen el desempeño de los laboratorios y que permiten asegurar sus resultados.
La primera de ellas es la PCR directa que constituye una gran herramienta para genotipificar sin requerir de purificación previa de DNA. Esto es posible gracias a la utilización de Taq Polimerasas robustas con gran resistencia a inhibidores y a la optimización de las condiciones para que la enzima logre su mayor rendimiento y fidelidad. La base tecnológica de Thermo ScientificTM se constituye de dos enzimas de gran procesividad: Phusion y Phire DNA polimerasas; las que permiten obtener productos de PCR específicos, con precisión, en mayor cantidad y a una velocidad inalcanzable respecto de otras polimerasas.
Este se aplica a una gran variedad de tejidos, como es el caso de una gota de sangre humana, pelos, saliva, trozos de tejido vegetal y muestras no invasivas tomadas desde animales. Lo anterior no solo disminuye los costos de preparación de muestras, sino que también posee otros atributos, por ejemplo:
a) utilizan cantidades pequeñas de material.
b) impide el sufrimiento de animales de experimentación.
c) toleran la presencia de mioglobina (músculo), colágeno, melanina y eumelanina (pelos y piel), inhibidores clásicos que están presentes en muestras denominadas difíciles.
Estas características, en su conjunto, permiten la obtención de resultados de manera rápida, con un alto rendimiento y fidelidad, para posteriormente, cargarlos directamente sobre los geles.
Otras alternativas de tipificación rápida y menos costosas las constituyen los ensayos para testear parentesco e identificación individual de Bovinos, Equinos y Caninos, dirigida a la tipificación de microsatélites o secuencias cortas repetidas en tándem (del inglés, Short Tandem Reapeat Loci, STR). Estos marcadores consisten en secuencias de 2 a 7 pares de bases de largo, repetidas en tándem, cuya cantidad de repeticiones permite dar cuenta de la diferencia entre individuos para un loci determinado. Gracias a su alto nivel de polimorfismo y herencia mendeliana, los microsatélites se han convertido en los marcadores más utilizados para parentesco e identificación individual.
En este último caso, Thermo ScientificTM cuenta con kits de Genotipificación multiplex específicos para Bovinos (F-904, F-900 y F-847), Equinos (F-850) y Caninos (F-860) optimizados para estudios de parentesco y clasificación de raza. Se encuentran diseñados para muestras de pelo, saliva y gotas de sangre, desde las que se obtiene ADN genómico de alta calidad mediante los métodos de extracción tradicionales. Los alelos para cada loci se resuelven mediante la aplicación de estos kits de PCR multiplex de alta eficiencia, separados por electroforesis capilar y detectados mediante fluorescencia inducida para multifluoróforos.
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